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革兰氏染色的关键步骤是：乙醇脱色（脱色时间）。如果脱色过度，革兰氏染色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如果脱色过短，革兰氏染色过度，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇的用量等因素的影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为20-30s）。

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