1 附件 6 体外皮肤变态反应 ARE-Nrf2 荧光素酶 LuSens试验方法 In Chemico Skin Sensitisation The ARE -Nrf2 Luciferase LuSens Test 1 范围 本方法规定了体外皮肤变态反应 ARE-Nrf2 荧光素酶 LuSens试验的基本 原理、试验方 法和技术要求。 本方法适用于化妆品用化学原料潜在致敏性的评价。 2 试验目的 本试验 通过检测体外培养的 LuSens细胞荧光素酶的表达变化，以评价受试物引起皮肤 变态反应的可能性。 3 定义 3.1 75% 细胞存活率浓度值 the estimated concentration resulting in 75% cell viability （CV75） 受试物染毒后，细胞存活率为 75%时对应的受试物浓度值。 3.2 抗氧化反应元件 antioxidant response element （ARE ） 存在于 细胞保护基因的启动子区域，能够响应氧化应激并调控相关基因表达的作用元件。 3.3 荧光素酶活性诱导倍数 fold luciferase activity induction （Fold Induction ） 扣除空白对照后，受试物和溶剂对照的细胞发光比值。 4 试验的基本原 理 致敏物质接触皮肤后，角质形成细胞被激活，诱导炎症反应及特定细胞信号通路相关基 因的表达。体外培养含有荧光素酶报告基因的人角质形成细胞（LuSens 细胞），暴露于受 试物，通过计算细胞相对存活率和荧光素酶活性，从而预测受试物是否具有皮肤致敏性。 5 试验材料与试剂 5.1 细胞 含有 ARE荧光素酶报告基因的人角质形成细胞株（ LuSens细胞株）。 5.2 培养基 细胞培养液 1：DMEM 培养液中加入 10%胎牛血清， 1%抗生素， 0.005%的嘌呤霉素盐