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浅谈清洁验证的实施

1. 背景介绍《药品生产质量管理规范》(GMP)第一百四十三条规定，清洁方法应当经过验证，证实其清洁的效果，以有效防止污染和交叉污染。清洁验证应当综合考虑设备使用情况、所使用的清洁剂和消毒剂、取样方法和位置以及相应的取样回收率、残留物的性质和限度、残留物检验方法的灵敏度等因素。清洁验证必须有文件和记录，通常包括清洁验证风险评估报告以及清洁验证方案，验证过程和数据记录在验证方案中，方案执行完毕后，编写清洁验证总结报告中。首先制定《XXX生产线清洁验证风险评估报告》和清洁验证方案，一般在产品工艺验证时同步进行生产线的清洁验证，并评价生产线设备/器具现有清洗程序的可靠性，降低污染与交叉污染的风险，确保产品质量。为了保证结果的重现性和准确性，必须连续进行3次成功的清洁验证。如果实际的结果不符合可接受标准，进行偏差处理，并形成偏差报告。本文以成品生产线清洁验证阐述如何开展清洁验证。2. 清洁验证范围评估依据成品生产工艺以及每步工艺涉及到的生产设备/器材清洁验证范围进行评估，确定各设备、器材清洁验证的考察项目：➢ 待清洁设备保留时间：设备使用后至开始清洁时间不超过24h。本次验证时设备放置超过24h后再进行清洗，考察待清洁设备保留时间的合理性。➢ 清洗目标物残留：选择清洗目标物，计算最低允许残留限度，对设备/器具的清洗流程合理性及清洗效果考察。➢ 洁净设备保留时间：对设备/器具清洗后的洁净设备保留时间考察，用微生物负荷指标评价洁净设备保留时间的合理性。3. 清洗目标物选择评估（1）活性成分（首要考虑条件）药品一般由活性成分和辅料组成，通常相对于辅料，需要更关心活性成分的残留，因为活性成分可能直接影响下批产品的质量、疗效和安全性，所以活性成分残留必须作为清洁验证的合格标准之一。当存在两个以上的活性成分时，其中最难溶解的成分即可作为最难清洁物质。（2）溶解度清洗目标物的溶解度与清洗效果直接相关，物质在清洗剂中的溶解性越好，清洗时残留物越易清洗干净，故清洗目标物选择时需考虑物质的溶解性。溶解度评分标准：极易溶解1分，易溶2分，溶解3分，略溶4分，微溶5分，极易溶解6分，几乎不溶7分。（3）毒性清洗目标物毒性与药品安全性直接相关，毒性越大，清洗时越需关注清洗后残留，确保药品的安全性。毒性评分标准：微毒（致死量15 g/kg）1分，低毒（致死量5-15 g/kg）2分，中等毒（致死量0.5-5 g/kg）3分，高毒（致死量50-500 mg/kg）4分，剧毒（致死量少于5 mg/kg）5分。（4）成分浓度物料成分浓度越大，设备内表接触的单位面积残留物越多，清洗难度增加。物料成分浓度评分标准：＜10 mg/L 0.5分，10-100 mg/L 1.0分，100-1000 mg/L 1.5分，1-10 g/L 2.0分，＞10 g/L 2.5分。基于以上四方面，采用风险指数评估法，对成品生产线各设备/器具清洗目标物进行评估。如果设备、器材接触的物质包含活性成分，则活性成分为清洁验证考察的清洗目标物，其他成分不再进行评估，对成品生产线清洁验证范围内的设备/器具清洗目标物评估，评估结果见表2：4. 清洁验证可接受标准清洁验证评估方法包括目检和取样检测，取样检测可选择淋洗液法和擦拭法，首选擦拭取样法，可考察最难清洁部位的清洗目标物残留，对于难以擦拭取样的（如硅胶管或滤芯等），可采用淋洗水取样。4.1. 目检可接受标准在清洗完后，首先对设备/器具内表目检，不得有肉眼可见的残留物。由于设备内表面抛光良好，目检能发现≥ 4 μg/cm2 的残留。4.2. 化学残留可接受标准（1）除菌过滤管道和灌装管道除菌过滤管道和灌装管道为一次性使用，使用后即废弃，所以不需考虑化学残留。（2）分液器和灌针➢ 采用化学浓度限度（10 ppm）法:即上一批次清洗目标物残留在下一批次中的残留物数量应不超过下一批批量的十万分之一（10 ppm）。设下一批次批量为 A（kg），则残留物浓度最高为 10×10 -6 即 10 mg/kg，则残留物总量下限值为 A×10×10 -6=10 A（mg）；假设分液器和灌针内表面积为B cm2，计算单位面积擦拭残留量10 A/B mg/ cm2，25 cm2擦拭残留量的可接受标准为 250 A/B mg。➢ 淋洗液限度：残留总量为10 A（mg），用 2L 注射用水进行淋洗取样，淋洗水残留的浓度限度为 5Amg/L，目标产品碳含量为 C%，折算 TOC 值=5A×C%ppm=0.05 AC ppm，如果数值高于注射用水 TOC 0.5 ppm 的标准，以注射用水 TOC 标准作为灌装器材淋洗法取样可接受残留标准。➢ 棉签擦拭限度：擦拭残留量的可接受标准为 250 A/B mg，棉签擦拭后用 45 mLTOC 检查用水润洗棉签，擦拭残留的浓度限度为5.56 A/B mg/L，目标产品碳含量为C%，折算 TOC 值=5.56 A/B×C%ppm=0.06 AC/B ppm，如果数值高于注射用水 TOC 0.5 ppm 的标准，以注射用水 TOC 标准作为灌装器材棉签擦拭可接受残留标准。4.3. 微生物限度可接受标准取样按注射用水微生物限度标准（≤10 CFU/100 mL）考察。4.4. 细菌内毒素残留按注射用水标准（＜0.25 EU/mL）检测细菌内毒素残留。5. 清洁验证考察项目汇总综合以上描述，同时根据设备擦拭部位评估，对成品生产线清洁验证考察项目汇总，见表3.6. 取样程序6.1 活性成分残留取样程序➢ 棉签法取样：棉签蘸少量润洗溶液（如0.1 mol/L氢氧化钠溶液），擦拭取样范围为25 cm2，首先横向擦拭，然后翻转棉签再纵向擦拭，注意棉签沿一个方向擦拭，不允许来回擦拭。注意对于设备内部擦拭面积不足25 cm2时需计算实际擦拭面积。擦完后棉签放入TOC检测瓶中，加入45 mLTOC检查用水浸泡40 min以上，用TOC仪检测。➢ 淋洗水取样：取最后一次淋洗水，或清洁结束后用适量的注射用水淋洗设备/器材内部，接取淋洗水。6.2 微生物/内毒素取样程序用规定量的注射用水淋洗设备内部，接取淋洗水。6.3 样品编号原则对于擦拭棉签样品、淋洗水样品、微生物样品，按照正常工艺流程，对各个取样点进行编号。7. 验证方案7.1 洁净设备保留时间验证确认分装器具按照清洗SOP 清洗和存放后，内表面残留物限度是否符合可接受标准。7.1.1 方案➢ 除菌过滤管道、分液器、灌装针、灌装管道使用前，按照清洗操作规程完成清洗，清洗后目视检查无残留。➢ 淋洗液取样：将除菌过滤管道、分液器、灌装针、灌装管道连接，用注射用水淋洗，取淋洗液检测 pH、电导率、 TOC、细菌内毒素、微生物限度。➢ 化学残留擦拭取样：用 0.1 mol/L 的 NaOH 溶液润湿棉签，对分液器内部出液嘴焊接处进行擦拭取样，擦拭面积约 25 cm2。➢ 取样完成后，沥干器具内表面水分，包扎后存放24 h 后，按照7.1.1方法对器具内表面进行取样，重复进行 3 次。➢ 注意事项：取样按照编号规则标注样品，避免混肴；棉签擦拭后，用TOC检查用水浸泡棉签40 min 以上，检测TOC总；清洁验证棉签擦拭时，清洗目标物残留TOC残留=TOC总-TOC擦拭空白，TOC擦拭空白为棉签+TOC 瓶+TOC检查用水的总TOC值。7.1.2 可接受标准淋洗液 pH、电导率按照工艺要求的标准，TOC标准按照4.2化学残留可接受标准，细菌内毒素、微生物限按照注射用水标准。7.2 待清洁设备保留时间和清洗目标物残留验证确认分装器具使用结束后按照清洗SOP清洗后，内表面残留物是否符合可接受标准。7.2.1 方案➢ 生产结束，将分液器、灌针放置24 h后按照器具清洗操作规程对器具进行清洗。➢ 淋洗液取样：清洗后将分液器和灌针连接，用注射用水淋洗，取淋洗液检测pH、电导率、TOC。➢ 化学残留擦拭取样：用 0.1 mol/L 的 NaOH 溶液润湿棉签，对分液器出液嘴焊接处进行擦拭取样，擦拭面积 25cm2。➢ 注意事项：取样按照编号规则标注样品，避免混肴；棉签擦拭后，用TOC检查用水浸泡棉签40 min 以上，检测TOC总；清洁验证棉签擦拭时，清洗目标物残留TOC残留=TOC总-TOC擦拭空白，TOC擦拭空白为棉签+TOC 瓶+TOC检查用水的总TOC值。7.2.2 可接受标准淋洗液 pH、电导率按照工艺要求的标准，TOC标准按照4.2化学残留可接受标准。8. 验证报告在验证报告中汇总三批验证的结果，并进行科学的分析，确认实施过程和结果完全符合要求，无未解决的偏差存在，并得到最终的结论，确认该清洁方案被授权于XX项目成品生产的器具清洁。如不符合，必须重新选择合适的清洁方案。CIO合规保证组织，为广大药企提供药品生产合规整体解决方案委托定制服务。点击下方链接，提交您的需求！相关文件下载、服务及学习课程：合规文库：药品生产企业质量管理管理规程模板—2022版合规培训：工艺验证与工艺设计（上）委托定制：药品生产合规整体解决方案（筹建、许可申请及认证）联系专家，获取专家指导意见：e邀专家*以上文章仅代表作者个人观点

发布日期：2023-04-12

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成品生产–除菌过滤工艺表征研究

1. 背景介绍生物大分子(单抗/双抗/ADC)的成品生产工艺包括原液解冻工艺、除菌过滤工艺、灌装工艺、冻干工艺（冻干剂型）等主要步骤。成品生产工艺中操作参数可能会影响到以下关键质量属性CQA：水分含量（冻干剂型）、SEC纯度、无菌、不溶性微粒、微生物限度、吐温含量、蛋白质含量、装量等。在商业化生产三批工艺验证PV时，已经确定成品生产工艺，在这之前，需要确认生产工艺，就需要对生产工艺操作参数进行工艺表征PC。本文重点介绍除菌过滤工艺的表征研究，主要关系到产品的无菌、SEC纯度、不溶性微粒、吐温含量、蛋白质含量等。依据除菌过滤工艺影响到的CQA，对工艺参数进行风险评估。风险评估采用失败模型影响分析（FEMA）工具进行分析，失败模型影响分析评分内容包括严重性S（Severity），发生的可能性O（Occurrence）和结果的可发现性D（Defection），根据风险优先指数RPN（RPN=S×O×D），制定表征研究策略。失效模型的评分标准见表1。2. 除菌过滤工艺表征研究抗体类成品为非最终灭菌的注射剂型，抗体原液需要进行除菌过滤，目的是达到注射剂的无菌要求。除菌过滤工艺的表征主要从过滤膜吸附表征研究、压力表征研究、过滤膜通量表征研究等方面进行考察。2.1.1 设备与材料电子天平、恒压过滤容器（1 L压力罐）、过滤膜（0.22 μm孔径 /4.5 cm2膜面积/PES膜材质）2.1.2 滤膜吸附表征研究除菌过滤膜材可能对抗体类成品中的蛋白质和吐温产生吸附，吸附导致蛋白质含量和吐温浓度的下降，可能会影响蛋白质的稳定性或者药效，但其它辅料均为小分子物质不易被吸附，容易透过 0.22 μm 的膜。因此商业化生产时，需要确认过滤膜材对蛋白质和吐温的吸附，以确保除菌过滤前后的蛋白质含量和吐温浓度在可接受范围内。实验室环境下，利用 scale down 缩小模型，使用与的生产时相同材质的除菌过滤膜，膜面积 4.5 cm2的小型过滤膜，模拟成品生产过程中的原液除菌过滤操作。在过滤过程中，使用与生产时相同的过滤压力如 0.15 bar，在不同时间点下取样，考察过滤过程中的蛋白质含量（15.0±1.0 mg/mL）、吐温浓度（0.08±0.04 mg/mL）的质量变化情况。结果表明在过滤过程中，随着过滤体积的增长，小型0.22 μm过滤器（PES膜、4.5 cm2）对蛋白质含量均无吸附影响。在过滤初期，滤膜对吐温有少量吸附，当过滤载量达到1.3 mL/cm2（过滤体积6 mL）时，达到吸附饱和，后期无明显吸附。故在商业化生产除菌过滤时，以过滤膜面积计算需要排空的体积，等滤膜达到饱和吸附后进行灌装，对成品生产中吐温含量无明显影响。2.1.3 除菌过滤压力表征研究在除菌过滤中，无论是采用恒压过滤还是恒流过滤，过滤压力越高（流速越快），产生的剪切力越大，对抗体类蛋白纯度稳定性影响越大。采用最差条件方法进行考察，即在最大压力下进行过滤，考察过滤样品的质量指标，确定除菌过滤压力可接受范围。在实验室环境下，使用与生产所用相同材质的小型过滤膜（0.22μm/ PES膜/4.5 cm2）作为缩小模型，模拟生产过程中的原液过滤操作，分别设定过滤压力3.0 bar、2.0 bar，过滤前后取样考察SEC纯度，暂不考察无菌以及不溶性微粒。在3.0 bar、2.0 bar过滤压力下，过滤前后SEC-HPLC纯度（聚体、主峰、片段比例）均未显著性有变化，故在生产中的过滤压力可接受范围为≤3.0 bar。2.1.4 过滤通量表征研究抗体类蛋白除菌过滤在确定滤膜材质后，需要在scale down模型下，测试除菌过滤器的通量，来满足除菌过滤时间内完成一定体积的除菌过滤操作。采用通用的过滤模型公式：d2t/dV2=k（dt/dV）n，其中t =过滤时间、V =滤过体积、k =常数、n =堵塞模型。对于符合逐渐堵塞模型的料液，上述公式中n =1。如果以t/V 和t 作图，两者为线性关系，就可以预测长时间过滤后的堵塞情况，故可以对工艺所需要的过滤膜面积进行计算。Vmax技术选型试验：通过恒压过滤试验，将过滤得到的数据拟合计算出Vmax（滤器能处理的最大过滤载量）和滤器的初始过滤通量，计算出工艺时间内处理料液所需的除菌过滤器最小面积，再结合操作安全系数，得到最终的除菌过滤器选型。对于非堵塞型料液（类似水），在室温下其粘度接近于1 cp，且通常不会堵塞滤膜。可以在同种小型除菌过滤器上通过压力流速实验计算出不同压力下的过滤通量，在保持过滤通量一致的原则下，可线性放大得到最终的除菌过滤器配置。依据以上设计思路，本次采用与生产同材质同孔径的小型过滤器（缩小模型）来进行一系列实验，摸索抗体类成品商业化生产过程中除菌过滤操作参数范围，为除菌过滤工艺操作参数的设定提供数据支持。首先进行Vmax实验，在0.15 bar过滤压力下小型过滤膜（0.22μm/ PES膜/4.5 cm2）记录各个时间点下已过滤原液的体积，以t为横坐标，t/v为纵坐标作出该小型滤器的拟合线性回归曲线。曲线需满足相关系数R²>0.99，建立线性回归方程曲线。根据除菌过滤Vmax实验数据图可知： Vmax回归曲线R2=0.873＜0.99，即t/V和t不存在线性关系，即n≠1，故此料液不属于堵塞性液体过滤物料。判断出抗体类原液不符合逐渐堵塞模型，接下来进行压力流速曲线实验：在不同压力下将原液通过小型过滤器（缩小模型），并在一定时间间隔（如1 min）记录滤过液体积，计算不同压力下的过滤流速（各个点的平均流速），以流速（mL/min）为横坐标，压力（bar）为纵坐标作出该小型滤器的曲线图，拟合线性回归曲线。曲线需满足相关系数R²>0.99，建立线性回归方程。依据过滤压力流速曲线图：回归方程y=0.03x+0.06，其中y代表过滤压力bar，x代表过滤流速mL/min，回归曲线R2=0.9961>0.99，回归方程具有统计学显著意义。在0.2 bar压力下，缩小模型膜面积 4.5 cm2得到的过滤通量约为 622 L/h/ m2，商业化生产过滤工艺按照过滤通量保持一致的原则，进行scale up放大，除菌过滤工艺要求 2小时内完成 100 L原液的过滤，则需要选择膜面积≥1200 cm2的除菌过滤器（安全系数 1.5）。CIO合规保证组织，为广大药企提供药品生产合规整体解决方案委托定制服务。点击下方链接，提交您的需求！相关文件下载、服务及学习课程：合规文库：药品生产企业质量管理管理规程模板—2022版合规培训：工艺验证与工艺设计（上）委托定制：药品生产合规整体解决方案（筹建、许可申请及认证）联系专家，获取专家指导意见：e邀专家*以上文章仅代表作者个人观点

发布日期：2023-03-31

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